生物洁净室无菌工艺试验

生物洁净室无菌工艺模拟试验是采用微生物培养基代替产品对无菌工艺进行评估的验证技术。无菌工艺模拟试验也被称为培养基灌装或培养基灌装试验，通常需要将培养基暴露于设备、容器密封系统的表面和关键环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。然后将装有培养基的密封容器进行培养以检查微生物的生长，并对结果进行评价，以确定实际生产中产品被污染的概率。

培养基灌装试验需要模拟整个工艺过程，包括从部件、材料的灭菌准备，配制混合，无菌过滤，灌装，一直到完成容器密封的整个过程。培养基灌装是用于评估整个无菌工艺过程，用以表明如果严格按照工艺要求生产，产品的无菌性有可靠保证；但须承认，不管模拟试验还是实际生产总是存在差异的，因此不能将培养基灌装结果与实际生产中的污染概率等同起来，即使获得很好的培养基灌装结果，也不能排除实际生产发生污染的可能性。

培养基灌装应在实际生产相同的条件(环境、设备等)下尽量模拟实际生产完成操作。应充分考虑生产时可能造成污染的各种因素，应对常规生产中的各种干扰活动进行模拟，应模拟常规生产可能遇到的较差条件状况下的操作。

1. 生物洁净室培养基灌装技术

培养基的选择和处理，培养基灌装试验频率，生产线较长允许运行时间(长时间生产可能导致污染增加)，班次更换、暂停及必要的更衣，灌装批次量，生产线的运行速度及设置，实际生产可能出现的正常干扰次数、类型及复杂程度，以及非常规的干扰和活动(如设备维修、中断、设备的各种调整)，环境监测方案和取样操作，关键区域内较多可容纳的总人数及人员可能的活动，容器的密封系统(如规格、大小、类型、对设备的兼容性)，无菌条件下的运输、转移次数(如容器转移、加胶塞、加无菌原辅材料)，只有经过培养基灌装的人员才能参与实际无菌生产，培养基灌装后应随即对生产设施和设备清洗和灭菌，避免残留培养基造成污染。

2. 生物洁净室培养基灌装培养基的选择

胰酪大豆胨液体培养基(TSB) 是一种广谱性培养基，特别对无菌工艺环境中源自人体的细菌、芽孢和真菌有良好的促生长效果，是无菌工艺模拟试验常用的培养基。如果产品需充入惰性气体、储存在无氧条件，无菌操作在严格的厌氧环境(即氧气浓度低于0.1%)中进行时，应评估是否采用厌氧培养基。在厌氧的无菌工艺环境监控中反复发现厌氧微生物或在产品无菌检查中发现厌氧微生物时，需评估增加厌氧培养基。用于模拟抑菌性产品的培养基，如有必要需评估抑菌性产品对其促生长能力及模拟试验结果的影响。促生长试验的指示菌除了相关规定以外，还应考虑使用环境监控和无菌检查中的分离菌，以代表实际生产中的可能遇到的污染菌，促菌生长试验的接种量应不超过100CFU。

3. 生物洁净室培养基灌装运行试验次数及频率

新建无菌生产线，在正式投产之前，每班次应当连续进行3次合格的模拟试验。正常生产期间应当按照每条生产线每班次每半年进行一次试验， 每次至少一批。 对于因其他原因停产一定周期的生产线，在恢复正式生产前应进行无菌工艺模拟试验。如是再验证，日常生产中，针对微生物污染事件而制定了纠正措施，在模拟试验时，可对纠正措施的有效性给予确认。若空气净化系统、生产用设备、无菌生产工艺及人员有重大变更，或设备有重大维修后，应评估确定无菌工艺模拟再试验的批次数，充分评估生产线的风险。在发现设施、人员、环境或工艺的持续监测出现不良趋势或无菌不合格时，也应考虑再次进行模拟试验。

4. 生物洁净室培养基灌装数量及模拟持续时间

无菌工艺模拟灌装数量应足以保证评价的有效性及完成模拟方案中设计的各种干预活动。应通过评估对所设计的灌装数量、持续时间、模拟方式、预期收率作出合理说明。

生产批量小于5000支，模拟灌装批量应至少与生产批量相同；产品的生产批量在5000~10000支，模拟灌装数量应与产品实际的生产批量相当；大规模生产，即产品的生产批量大于10000支，较低模拟灌装数量应不得低于10000支；对于超大批量的生产规模，如大于100000支，则应考虑适当增加模拟的灌装数量；如采用密封性生产设备，可适当降低模拟数量。

5. 生物洁净室培养基灌装运行速度

培养基灌装试验方案应阐明生产线运行的速度范围，每次运行试验中，应对单一生产线的速度作出评估并说明锁定速度的理由。比如大敞口容器的低速运行一般适用于评估无菌产品、 容器、胶塞在无菌区暴露时间比较长的工艺，高速运行则比较适用于评估那些存在大量手工干扰的生产工艺。

6. 生物洁净室培养基灌装容器装量

容器中培养基灌装体积应考虑适宜微生物生长的需要和容器内表面覆盖的要求。灌装体积不必与产品相同，但合适的灌装量既应保证产品通过倒置和旋转接触到所有内表面并有足够的氧气支持微生物的生长，又应利于对培养基的观察。

7. 生物洁净室培养基灌装干预设计

干预是由操作人员按照相关规定参与无菌工艺生产的所有操作活动。干预可分为固有干预和纠正性干预。固有干预是指常规和有计划的无菌操作，如装载胶塞、 环境监控、设备安装、部件组装等；纠正性干预是对无菌生产过程的纠正或调整，如生产过程中清除破碎的瓶子、排除卡住的胶塞、更换部件、设备故障排除等。54.vip永利皇宫棋牌净化可提供生物洁净室、无菌室的咨询、规划、设计、施工、安装改造等配套服务。

无菌模拟试验方案中应明确规定固有干预和纠正性干预的频次、类型及复杂程度，如倒瓶剔除等进行简单干预；灌装机泵及针头装配、设备故障维修等进行复杂干预。固有干预及经常发生的纠正性干预一般应在每次模拟中都实施，偶发性的干预可周期性地模拟，如无菌生产过程意外暂停或重启，无菌状态下设备、设施偶发故障排除等。

模拟试验应设计并实施足够数量的纠正性干预，干预频次的设计应考虑实际生产情况，按比例覆盖模拟试验的全过程。对于无菌取样、调整装量过程，均应考虑在分装的前、中、后阶段进行。

实施干预的人员(应包括操作、维修人员等)应经过相关的培训和考核，并能按规定的程序实施各种干预。标准化的、简单的固有干预可由部分操作人员实施并据此评价其他人；对于复杂操作，如装配灌装机等，每个从事该操作的人员都应在验证过程中模拟，操作条件不应优于日常生产的操作条件。

8. 生物洁净室 干预后产品(容器)的处理

实际工艺中如明确规定受干预影响的产品(容器) 应从生产线上剔除，在模拟试验时也可剔除；模拟试验时产生的这类产品(容器)可不培养，但不培养的容器应予以记录并评估其合理性；如在干预发生前已经密封，在日常生产中按规定不需要剔除的产品，模拟试验时也应保留、培养并纳入评估。

模拟试验过程中的所有干预须记录，纠正性干预记录的内容至少应包括纠正性干预的类型、位置、次数；固有干预记录至少包括干预内容和发生频率。

9. 生物洁净室环境条件及监测

培养基灌装试验的环境条件应充分体现生产操作的实际情况，不应该采取特别的生产控制和预防措施，制造特别良好的工艺环境，这样会导致不准确的评估结论，造成工艺条件良好的假象。需要注意的是，不应当人工创造极端的环境条件(如对净化空调重新调整，使其在较差的状态下运行)进行验证，对于环境较差条件的挑战应当是在工艺允许的苛刻条件范围内对环境受干扰程度(如生产现场人员较多、生产活动频率较高)的挑战。

在培养基灌装过程中也应当进行环境监测，环境监测的方案可以与日常监控不同，但监测要求不能低于日常生产。

10.人员培训

所有被授权在生产时进入无菌区的人员，包括观察人员和维修人员，每年至少应参加一次培养基灌装试验。所有实际生产中将在关键区域进行操作的人员都应该参加每次的培养基灌装，参与人员应按照常规生产的职责模拟与其相关的活动。

在培养基灌装前须准备好方案和相关文件，应对人员职责进行方案说明，比如监督和观察职责如何实施；所有参与培养基灌装的人员应当经过适当培训以保证他们对方案和实际实施有足够的了解。

11.容器/密封件规格及切换

有些情况下同一生产线可能用于不同大小容器的灌装。一般来说培养基灌装可以针对规格较大和规格较小的容器进行，除非其他不同规格容器的灌装工艺有很大差别，在初始验证时可以进行两次大规格容器和一次较小规格容器的灌装挑战；在以后的周期性半年度灌装可以轮换，每次挑战一种规格，对于生产线切换不同规格产品的操作会增加污染，因此在验证时也要挑战切换操作。

12. 容器/密封件系统的完整性测试

无菌容器/密封件系统的完整性测试可以在培养基灌装时进行，可以采用微生物侵入试验来评价密封完整性，即将灌装了无菌培养基的容器按照实际生产的流程进行密封后置于浓度不低于10⁶CFU/ml的菌悬液中，然后进行培养检查以评估系统的完整性。

13. 生物洁净室培养基灌装培养与检查

①培养条件：应对容器进行翻转、倒置等，确保培养基接触容器( 包括密封件)的所有内表面，培养时间至少14天；可选择两个温度进行培养：在20~25℃培养至少7天，然后在30~35℃培养至少7天；如选择其他培养计划，应有实验数据支持所选培养条件的适用性，在整个培养期间应连续监控培养温度。

②培养结束后，应对所有模拟灌装产品逐一进行无菌性检查，通常应在合适的照度下进行目视观察。在培养期间定期观察培养基的培养情况，如在培养期间发现异常情况时应进行进一步调查； 如在检查中发现密封缺陷的灌装产品，应进行适当的原因调查并采取纠正措施。

③计数与数量平衡：为保证模拟试验结果的可靠性，应对各阶段灌装数量进行准确计数，如灌装数量、干预剔除数量、培养前和培养后无菌检查数量，各阶段数量应平衡。如发现不平衡，应调查原因并判断本次模拟试验结果的有效性。

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